Действие игры разворачивается в Италии, в Эпоху Возрождения, конец XV века. Главным героем игры становится семнадцатилетний юноша по имени Эцио. Отца Эцио, Джованни Аудиторе, предал его лучший друг, и в ходе обвинения, отец и братья Эцио были повешены. Для Эцио это была душевная травма, потерять семью. Он убивает предателя его отца и пытается укрыться вместе с матерью и сестрой у своего дяди Марио, на вилле Аудиторе в Монтериджони.

Позже Эцио узнает, что его семью предала семья Пацци, и он решает поквитаться с ней. Сперва он убивает младшего из этой семьи, Вьери Пацци, потом его отца, Франческо Пацци, а затем старшего из семьи предателей — Якопо Пацци — и его помощников.

Действие прерывается и переносится в настоящее время. В ходе интермедии Люси проверяет навыки Дезмонда. Во сне у Дезмонда возникают галлюцинации, и он видит события из жизни Альтаира, главного героя предыдущей части. На следующий день Дезмонд вновь погружается в воспоминания Эцио.

Из собрания тамплиеров, в котором непосредственно участвовал Якопо, Эцио узнал, что его приключение заводит его в Венецию, где он и гильдия воров убивают одного из заговорщиков — Эмилио Барбариго, а также Карло Гримальди, который отравил венецианского дожа Джованни Мочениго. Затем Эцио убивает Марко Барбариго, занявшего место прежнего дожа, позднее Эцио убил Сильвио Барбариго и телохранителя Марко Данте Моро. Но он упустил корабль, на котором те собирались уехать. Через два года он узнаёт, что скоро возвращается корабль тамплиеров с острова Кипр, и на нём, вероятно, будет одна из частиц Эдема. Следуя за курьером, Эцио лицом к лицу сталкивается с Родриго Борджиа, который убеждён, что он некий пророк. Борджиа удаётся скрыться, но Эцио узнаёт, что люди, помогавшие ему на всём пути — ассасины. После нахождения частицы Эдема — яблока Эдема — Эцио отправляется в Романью, где помогает Никколо Макиавелли и Катерине Сфорца защитить их город — Форли. Но таинственное яблоко было украдено, и поиски его приводят нашего героя обратно во Флоренцию. Воспользовавшись яблоком, Джироламо Савонарола захватывает власть во Флоренции, но Эцио убивает девять сторонников Савонаролы по всему городу, подрывая его планы. Разгневанный народ собирается заживо сжечь «просветителя», но Эцио убивает его раньше.

Пройдя посвящение, он направляется в Рим, где ему предстоит раз и навсегда разобраться с Борджиа, который стал Папой Римским. Одолев противника, Эцио узнаёт, зачем Родриго стал Папой Римским и зачем он охотился за частицами Эдема. Весь секрет в том, что под Римом покоится «бог», попасть в гробницу которого может только пророк, используя яблоко и посох. Пророком оказывается сам Эцио, не знающий о пророчестве, но просто следуя своей судьбе, он исполняет его. В гробнице Эцио узнаёт от некой Минервы, что люди были созданы инопланетной расой, которую древние люди принимали за богов, но они давно погибли от загадочной катастрофы, та же участь ждёт Землю, и Дезмонд единственный, кто может помешать этому. Тем временем в наши дни в логово ассасинов вторгаются люди «Абстерго», и Дезмонду, Люси, Шону и Ребекке приходится бежать…

Комментарий от меня:Я играла и в первую часть.Но эта более захватывает.Советую поиграть